Hochreine Polymerase mit "proofreading" Aktivität. Unentbehrlich für Amplifikationen mit hoher Replikationsgenauigkeit - sparsam im Preis

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Pfu/Psp DNA Polymerase: Datenblatt
Pfu/Psp DNA Polymerase: English description

Features/Beschreibung:
Pfu/Psp-DNA-Polymerase ist eine hochprozessive 5'→3'- DNA-Polymerase mit einer zusätzlichen 3'→5'-Exonuklease-Aktivität (proofreading). Eine 5'→3'-Exonuklease-Aktivität ist nicht vorhanden. Pfu/Psp-DNA-Polymerase ist besonders hoch aufgereinigt. Im Vergleich zu anderen Polymerasen ist das Enzyme thermostabiler und hat eine ca. 10-fach höhere Genauigkeit gegenüber der Taq DNA Polymerase. Die PCR Produkte sind "blunt-end".

Anwendungen:
- "blunt end" PCR Klonierung
- "High-fidelity" PCR
- Primer-Extensions Reaktionen

Konzentration: 5 u/µl

Einheitendefinition:
Eine Unit ist die Enzymmenge, die benötigt wird, um 10 nmol dNTP in 30 min bei 72 °C in säureunlösliche Substanz zu überführen.

Lagerpuffer: 
50 mM Tris-HCl, pH 8.2, 0.1 mM EDTA, 0.1% Tween 20, 0.1% Nonident P40, 1 mM DTT, 50% Glyzerin

10 X Reaktionspuffer:
100 mM KCl, 160 mM (NH₄)₂SO₄, 20 mM MgSO₄, 200 mM Tris-HCl, pH8.8, 1% Triton X-100, 1 mg/ml BSA

Qualitätstests für Pfu:
- Frei von Endonukleasen
- PCR Tests mit Lambda DNA und humaner Plazenta DNA
- Reinheit: SDS-Page > 90 %

Anwendung  
- Verwenden Sie kein dUTP

Komponenten	Volumen/Reaktion	End-Konz.
10X Reaktionspuffer mit MgSO4	5 µl	1X
dNTP-Mix (40mM = 10mM pro Nukleotid)	1.0 µl	200 µM pro Nukl.
Up-stream primer (z.B. 20 µM)	0,5 µl	0.1-1.0 µM
Down-stream primer (z.B. 20 µM)	0.5 µl	0.1-1.0 µM
Template DNA (10 ng/µl)	1.0 µl	<= 0,5 µg
Pfu/Psp DNA Polymerase (5 u/µl)	0.2 - 0,4 µl	1-2 units
Steriles dest. Water (PCR-Grade)	up to 50 µl

Hinweis: 
- Alle Komponenten vor dem Ansatz vortexen
- Reaktionsgemisch auf Eis ansetzen
- Das Enzym nach der Template-DNA zusetzen
- Möglicherweise ist es erforderlich die MgSO₄ zu optimieren

Allgemeines Cycler-Protokoll:

Schritt	Zeit	Temperatur
Erste Denaturierung	1-3 min	95°C
25-35 Zyklen:  Denaturierung  Annealing  Extension	30-100 sec  30-65 sec  1-2 min    (per 1kb)	95°C  37-69°C  72-75°C
Finale Extension	5 min	72-75°C

Lagerung: bei  -20°C für 24 Monate

Transport: mit Kühlakkus

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