MMLV RT DNA-Polymerase ist eine genetisch modifizierte MMLV Reverse Transkriptase, deren RNase H-Aktivität deletiert wurde. Als Template zur Synthese von komplementären DNA-Strängen kommen sowohl RNA als auch DNA in Frage, wenn ein entsprechender Primer zugegeben wurde

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MMLV Reverse Transkriptase: Datenblatt
MMLV Reverse Transkriptase: English Description

Anwendungen:
- "End-labeling" von DNA
- RT PCR
- Erststrang-Synthese für RT-PCR-Reaktionen oder cDNA-Banken
- Zweistrang-Herstellung für cDNA-Banken oder Klonierungen
- Ausfüllen und Labeling von DNA-3' Enden mit 5'-Überhängen

Beschreibung:
M-MLV Reverse Transkriptase ist ein Genprodukt des Moloney Murine Leukemia Virus (M-MuLV) mit RNA abhängiger DNA-Polymeraseaktivität. Die normalerweise vorhandene RNase H-Aktivität wurde durch eine Deletion depletiert. Das Molekulargewicht des Enzyms beträgt 69 kDa. 

Konzentration: 200 u/µl

Lagerpuffer:
200 mM Kaliumphosphat (pH 7.2), 0.2% Triton X-100, 2 mM DTT und 50% Glyzerin

Reaktionspuffer 5X:
250 mM Tris-HCl (pH8.3), 375 mM KCl, 15 mM MgCl₂  und 50 mM DTT

Einheitenbestimmung:
Eine Unit ist die Menge an Enzym, die 1 nmol dTTP mit poly(A)-oligo(dT) als Template-Primer bei 37°C in 10 min in säureunlösliches Material umwandelt.

Qualitätstests:
- Reinheit > 90 % in SDS-Polyacrylamidegel
- Endo- und Exonuklease Aktivitätstests
- Frei von RNase und DNase

Anwendung:  
Standard-Protokoll:
Wir empfehlen den Ansatz von zwei Mischungen

Mix I

Komponenten	Menge/Konz.
a. Total RNA  or  b. PolyA RNA  c. Strand-specific primer   or  d. Oligo dT / Randomprimer       pro µg of RNA	1-5 µg  50-500 ng  10 pM    250-500 ng
steriles Wasser (PCR-Grade)	bis 8 µl
Inkubation	Temperatur
10 Min	70 °C
10 - 15 Min (for c. spezifische Primer)  or  5 min (für d. Oligo dT / Randomprimer )	Raumtemperatur  auf Eis

Mix II

Komponenten	Menge/Konz.
5X Reaktionspuffer	4 µl
dNTP Mix (je 10 mM = 40 mM)	1 µl
optional: RNAsin	20-40 units
MMLV Reverase (200 u/µl)	200 units
steriles Wasser (PCR-Grade)	up to 20 µl
Mischen von Mix I und Mix II und vortexen

Schritt	Temperatur
30 - 115 Min 1.)	37 - 55°C 2.)
10 Min (Inaktivierung des Enzyms)	65-70°C

^1.) 30 Min für cDNA mit 500 bp; 115 Min für 1,5 kb
^2.)  Abhängig von RNA: Höhere Temperaturen (bis 55°C) für höher "strukturierte" RNA;  Ein pH-Wert von
     8.8 begünstigt die Reaktion

Transport: mit Kühlakkus

Lagerung: bei -20°C für 24 Monate


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